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目的探討1,2-二氯乙烷（1,2-DCE)亞急性暴露對大鼠抑郁樣行為的影響及其可能單胺神經(jīng)遞質(zhì)的作用 機(jī)制。方法無特定病原體級雄性SD大鼠隨機(jī)分為對照組和低、中、高劑量組，每組10只，分別予0、20、40、
80 mg/kg體質(zhì)量的1,2-DCE(以玉米油稀釋）灌胃染毒，每2天1次，連續(xù)染毒14次。染毒結(jié)束后，采用曠場實(shí)驗(yàn)、
糖水偏愛實(shí)驗(yàn)和強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)觀察大鼠行為學(xué)變化情況，采用液相色譜-電化學(xué)檢測法測定大鼠大腦前額皮 層、海馬、紋狀體中單胺類神經(jīng)遞質(zhì)5-羥色胺(5-HT)、去甲腎上腺素（NA)和多巴胺水平。結(jié)果與對照組比較，
中、高劑量組大鼠直立次數(shù)、中心區(qū)域活動時(shí)間和路程均減少（P <0.05),糖水偏愛度下降（P <0. 05),強(qiáng)迫游泳實(shí) 驗(yàn)中不動時(shí)間延長（P<0. 05)。大鼠前額皮層、海馬、紋狀體內(nèi)5-HT、NA和多巴胺水平均隨著1,2-DCE染毒劑量 的增加而下降（P <0.05),呈劑量-效應(yīng)關(guān)系。高劑量組大鼠前額皮層、海馬、紋狀體內(nèi)5-HT、NA和多巴胺水平均 低于對照組（P<0. 05)。結(jié)論1,2-DCE亞急性暴露可誘導(dǎo)大鼠抑郁樣行為，其機(jī)制可能與降低前額皮層、海馬、
紋狀體內(nèi)單胺類神經(jīng)遞質(zhì)的水平相關(guān)。
關(guān)鍵詞：1,2-二氯乙烷；抑郁癥；單胺類神經(jīng)遞質(zhì)；5-羥色胺；去甲腎上腺素；多巴胺；行為學(xué)；大鼠
1材料和方法
1.1動物無特定病原體級雄性SD大鼠廣東省實(shí) 驗(yàn)動物中心，實(shí)驗(yàn)動物生產(chǎn)許可證號:SCXK(粵）2013- 00002] 40只,體質(zhì)量180 ~220 g。大鼠飼養(yǎng)于廣東省 職業(yè)病防治院實(shí)驗(yàn)動物屏障設(shè)施（無特定病原體級動 物房）內(nèi)實(shí)驗(yàn)動物使用許可證號：SYXK (粵）2014- 0048],自由進(jìn)食和飲水。本研究經(jīng)廣東省職業(yè)病防 治院實(shí)驗(yàn)動物倫理委員會批準(zhǔn)。
1.2儀器和試劑曠場實(shí)驗(yàn)裝置、SuperMaze曠場試 驗(yàn)視頻分析系統(tǒng)（XR-XZ301,上海欣軟信息科技有限公司）；強(qiáng)迫 游泳實(shí)驗(yàn)裝置（為帶有高度標(biāo)記的透明圓柱形游泳 桶,上海欣軟信息科技有限公司）；0. 22 pm濾膜（上 海安譜實(shí)驗(yàn)科技有限公司）；Agilent RX~C18色譜柱 (250. 0 mm X 3.0 mm X5. 0 pm)、Agilent 1260 液 相色譜系統(tǒng)（美國Agilent公司）；CoulochemM電化學(xué) 檢測器（美國ESA公司）；Millipore超純水機(jī)（美國 Millipore 公司）。1,2~DCE (分析純，純度彡99. 50%, 廣州化學(xué)試劑廠）；玉米油（益海嘉里食品營銷有限公 司）；異氟烷（深圳市瑞沃德生命科技有限公司）；高氯 酸(優(yōu)級純），NA、-辛烷磺酸鈉、磷酸氫二鈉、乙二胺 四乙酸二鈉、三乙胺（均為色譜純度），5~HT、多巴胺（均 為分析純,上海阿拉丁生化科技股份有限公司）；乙腈 (色譜純，美國賽默飛世爾科技公司）。蛋白沉淀液為 含濃度為0.100 mmol/L的高氯酸和體積分?jǐn)?shù)為 0. 01%乙二胺四乙酸二鈉的水溶液。磷酸二氫鈉緩沖 溶液為含濃度分別為1. 700、25. 000、0. 025、0. 700 mmol/L的1-辛烷磺酸鈉、磷酸氫二鈉、乙二胺四乙酸 二鈉和三乙胺的水溶液,pH值為3. 0)。
1.3動物分組與染毒大鼠經(jīng)檢疫并適應(yīng)性飼養(yǎng) 1周后，采用隨機(jī)數(shù)表法分為對照組和低、中、高劑量 組，每組10只。本研究預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，雄性SD大 鼠半數(shù)致死量為681 mg/kg體質(zhì)量。參照本課題組前 期研究8 ,本研究設(shè)計(jì)1,2~DCE染毒劑量在低、中、高 劑量組分別為20、40和80 mg/kg體質(zhì)量。實(shí)驗(yàn)時(shí)，低、 中、高劑量組大鼠分別予質(zhì)量濃度為20、40、80 g/L的 1,2~DCE溶液（以玉米油配制）灌胃，灌胃體積為 1 mL/kg體質(zhì)量，對照組大鼠給予等體積玉米油灌胃； 隔曰灌胃1次，共染毒14次。實(shí)驗(yàn)期間觀察大鼠活 動、飲水飲食等情況。染毒結(jié)束時(shí),3組大鼠共攝入相 當(dāng)于0. 411、0.822、1.645倍半數(shù)致死量的1,2-DCE。 于末次染毒24 h后進(jìn)行行為學(xué)測試。
1.4行為學(xué)測試
1.4.1曠場實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)在4個(gè)涂黑敞箱內(nèi)進(jìn)行，敞箱 底面等分成25個(gè)正方形。實(shí)驗(yàn)在相對安靜的環(huán)境下 開始。將大鼠輕輕放入箱體中央，采集5 min內(nèi)大鼠 在箱內(nèi)的活動情況。中央和外周區(qū)域活動時(shí)間及路 程由Flyde-maze曠場試驗(yàn)視頻分析系統(tǒng)記錄，直立次 數(shù)由未知實(shí)驗(yàn)方案的研究人員記錄。
1.4.2糖水偏愛實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)前進(jìn)行大鼠糖水適應(yīng)性 訓(xùn)練:首先每籠放置2瓶糖水（質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.00%), 1 d后改為1瓶糖水和1瓶純水，連續(xù)放置24 h。大鼠 經(jīng)適應(yīng)性訓(xùn)練后，禁食禁水1 d,開始糖水偏愛實(shí)驗(yàn)。 實(shí)驗(yàn)開始前稱量1瓶糖水和1瓶純水的質(zhì)量后將其放 入籠內(nèi)由大鼠隨意飲用；24 h后，分別稱量糖水和純水的剩余質(zhì)量，計(jì)算消耗量,以分析大鼠的糖水偏愛度。 糖水偏愛度=糖水消耗量/總液體消耗量X100. 00%。 1.4.3強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)適應(yīng)性訓(xùn)練：實(shí)驗(yàn)前1 d,將 約23 °C的水注入強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)裝置內(nèi)，高度>30 cm; 將大鼠放入裝置，使其漂浮于水上，并使其下肢無法 觸及裝置底部以支撐其身體；當(dāng)大鼠適應(yīng)水溫和水環(huán) 境后,使其自由游泳6 min。24 h后，在相同的實(shí)驗(yàn)條 件下,進(jìn)行正式實(shí)驗(yàn)，觀察時(shí)間為6 min,觀察期內(nèi)大 鼠在桶內(nèi)自由游泳。由未知實(shí)驗(yàn)方案的研究人員記 錄大鼠2 ~6 min內(nèi)的不動時(shí)間。以大鼠停止任何掙 扎,漂浮于水面不動或僅做一些支持漂浮在水面的輕 微肢體活動定義為不動狀態(tài)。
1.5腦組織樣品采集及處理于行為學(xué)測試結(jié)束 后，將大鼠放入麻醉裝置中給予異氟烷吸入,麻醉后 經(jīng)腹主動脈采血，放血法處死。迅速取出全腦，于冰 上分離前額皮層、海馬和紋狀體等，置于凍存管，以液 氮迅速冷卻后，于-80 °C冰箱保存。檢測時(shí),從冰箱 中取出凍存的組織樣品，稱質(zhì)量后置于勻漿器中，按 1 g :5 mL比例加入預(yù)先冷凍4 C的蛋白沉淀液體，冰 浴下快速勻漿2 min。勻漿液于4 C、4 000 xg離心 30 min,取上清液用0.22 pm濾膜過濾后,待測。
1.6腦組織中單胺類神經(jīng)遞質(zhì)水平檢測參照文獻(xiàn) 9],采用液相色譜-電化學(xué)檢測法測定1.5制 備的大鼠海馬、前額皮層和紋狀體樣品中5~HT、NA和 多巴胺水平。色譜條件:流速1.0 mL/min;進(jìn)樣體積 20 pL;流動相組成A相（磷酸二氫鈉緩沖溶液）：B相 (乙腈）=90 : 10 (V/V);柱溫35 C ;檢測電勢： Et = -150 V,E2 =220 V。該方法的 5-HT、NA 和多巴 胺水平檢出限分別為1. 1、1. 0、1. 1 pg/L,加標(biāo)回收 率分別為 88. 60% ~ 94. 60%、93. 50% ~ 95. 10%、 89. 90% ~95.50%。
1. 7統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用SPSS 23. 0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分 析。計(jì)量資料經(jīng)正態(tài)性檢驗(yàn)符合正態(tài)分布，以x ± s描 述；多組組間均數(shù)比較采用單因素方差分析，組間均 數(shù)兩兩比較方差齊時(shí)采用SNK檢驗(yàn)，方差不齊時(shí)采用 Dennett T3法。采用一兀線性回歸分析1,2—)CE染 毒劑量與單胺神經(jīng)遞質(zhì)水平的劑量-效應(yīng)關(guān)系；檢驗(yàn)
水準(zhǔn)a =0.05 (雙側(cè)）。
2結(jié)果
2.1基本情況對照組和低劑量組大鼠毛發(fā)光澤、 精神狀態(tài)、活動、飲水和攝食均正常；中劑量組和高劑 量大鼠分別于染毒第9天和第5天后可觀察到活動和 精神狀態(tài)異常持續(xù)至染毒結(jié)束，表現(xiàn)為精神萎靡、俯 臥、活動減少、弓背。染毒周期內(nèi)各組大鼠均無死亡。 2.2行為學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)果與對照組比較，中、高劑量組 大鼠直立次數(shù)、中心區(qū)域活動時(shí)間及路程均減少，糖 水偏愛度下降，游泳中的不動時(shí)間延長，差異均有統(tǒng) 計(jì)學(xué)意義（P <0.05)。見表1。
2.3 1,2—)CE暴露對大鼠不同腦區(qū)中單胺類神經(jīng)遞
質(zhì)水平的影響4組大鼠前額皮層、海馬和紋狀體中 5~HT、NA和多巴胺水平分別比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意 義（P <0.01)。兩兩比較結(jié)果見表2?？梢?，高劑量 組大鼠3種腦區(qū)組織中5~HT、NA和多巴胺水平均低 于對照組,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P <0.05)。分別以 前額皮層、海馬和紋狀體的3種單胺神經(jīng)遞質(zhì)水平 (y)和1,2~DCE染毒劑量（x)進(jìn)行一元線性回歸分析， 結(jié)果顯示回歸方程均成立（P< 0.01)。隨著
表1 4組大鼠行為學(xué)指標(biāo)比較結(jié)果 （x±s)
組別 | 動物數(shù) | 直立次數(shù) | 中心區(qū)域活動 | 中心區(qū)域活動 | 總路程 | 糖水偏愛度 | 不動時(shí)間 |
(只） | (次） | 時(shí)間（s) | 路程（mm) | (mm) | (%) | C s) | |
對照組 | 10 | 25.5±5.7 | 21.8±6.5 | 175.5±24.0 | 1 838.9 ±299.4 | 71. 00 ± 8. 60 | 50.1 ?1.8 |
低劑量組 | 10 | 24.6±4.0 | 20.0 ±4.5 | 180.3 ?7.5 | 1 897.2 ?68.3 | 68.50 ?.80 | 55.8 ?0.4 |
中劑量組 | 10 | 19.5?.1ab | 15.0?.8ab | 147.7?4.2ab | 1 703.7 ?09.8 | 59.50?0.50a | 64.0?.8a |
高劑量組 | 10 | 17.4?.0ab | 13.9?.7ab | 140.7?6.4ab | 1 616.2 ?46.4 | 59.30?1.30a | 61.6?.9a |
F值 |
| 6.81 | 7.16 | 4.95 | 2. 04 | 4. 26 | 4. 36 |
P值 |
| <0.01 | <0.01 | <0.01 | 0. 12 | 0. 01 | 0. 01 |
注：與對照組比較，P <0.05;與低劑量組比較,bP <0. 05
表2 4組大鼠前額皮層、海馬、紋狀體中5~HT、NA和多巴胺水平比較（X御,ng/g)
組別 | 動物數(shù) |
| 5-HT |
|
| NA |
|
| 多巴胺 |
|
(只） | 前額皮層 | 海馬 | 紋狀體 | 前額皮層 | 海馬 | 紋狀體 | 前額皮層 | 海馬 | 紋狀體 | |
對照組 | 10 | 281.3±29.0 | 176.1 ?3.1 | 499.8?2.6 | 190.6±52.6 | 328.6 ?2.0 | 166.9?3.9 | 270.1 ?3.6 | 138.3?7.7 | 4738.2?25.5 |
低劑量組 | 10 | 266.2 ±32.8 | 159.1 ?6.9 | 471.2?3.4 | 179.3 ?2.2 | 323.0?1.4 | 161.9?6.5 | 256.3 ?0.8 | 121.9?9.2 | 4516.2?11.0 |
中劑量組 | 10 | 251.0±47.6 | 138.5?8.4a | 335.9?5.6ab | 122.6?4.8ab | 253.0 ?7.4ab | 109.7?0.5ab | 249.6?2.1 | 112.1?1.5a | 3 957.4?95.4a |
高劑量組 | 10 | 194.1?1.9abc | 102.4?6.5abc | 328.4?9.4ab | 119.8?3.7ab | 239.8 ?3.0ab | 97.4?7.9ab | 172.2?1.2abc | 74.9?0.0abc | 3 182.4?505.7abc |
F值 |
| 9.78 | 14.57 | 19.98 | 6.37 | 4. 86 | 5. 48 | 10.16 | 18.71 | 10.86 |
P值 |
| <0.01 | <0.01 | <0.01 | <0. 01 | <0. 01 | <0.01 | <0.01 | <0.01 | <0.01 |
注:與對照組比較,aP<0.05;與低劑量組比較,bP<0.05;與中劑量組比較,cP<0.05
表3 1,24)CE染毒與前額皮層、海馬、紋狀體5~HT、NA和多巴胺水平的劑量-效應(yīng)關(guān)系分析結(jié)果
單胺神經(jīng)遞質(zhì) |
| 回歸方程 | 決定系數(shù) | F值 | a值 | t值 | P2值 | |
5-HT | ||||||||
前額皮層 | y = | -1.10 x | ：+286.67 | 0. 44 | 29.44 | <0.01 | 30. 87 | <0.01 |
海馬 | y = | -0.93 x | ：+ 176.55 | 0. 55 | 46.06 | <0.01 | 28.14 | <0.01 |
紋狀體 | y = | -2.32 x | :+489.88 | 0. 49 | 36. 42 | <0.01 | 27.86 | <0.01 |
NA | ||||||||
前額皮層 | y = | -0.96 x | +186.65 | 0. 27 | 14. 08 | <0.01 | 15.94 | <0.01 |
海馬 | y = | -1.23 x | + 329. 02 | 0. 24 | 11.79 | <0.01 | 20.10 | <0.01 |
紋狀體 | y = | -0.95 x | + 167. 38 | 0. 26 | 13. 58 | <0.01 | 14.11 | <0.01 |
多巴胺 | ||||||||
前額皮層 | y = | -1.23 x | + 280. 08 | 0. 42 | 27.08 | <0.01 | 25.88 | <0.01 |
海馬 | y = | -0.78 x | +139.18 | 0. 60 | 57. 60 | <0.01 | 29.47 | <0.01 |
紋狀體 | y = | -20.17 | x +4 804.44 | 0. 47 | 33.53 | <0.01 | 30. 10 | <0.01 |
注:FPi值和t、P2值分別為回歸方程檢驗(yàn)和回歸系數(shù)檢驗(yàn)的結(jié)果
3討論
機(jī)體受到環(huán)境中病毒、細(xì)菌和有毒有害化學(xué)物質(zhì) 等因素影響后，在出現(xiàn)病理改變和臨床癥狀前通常會 出現(xiàn)行為功能障礙或其他指標(biāo)異常；特定行為學(xué)的改 變能夠準(zhǔn)確反映中樞神經(jīng)系統(tǒng)的生理或病理狀態(tài)，可 作為神經(jīng)毒性的前期指標(biāo)M。1,24)CE急性或亞急 性中毒主要臨床表現(xiàn)為中毒性腦病，腦水腫為主要病 理基礎(chǔ)tt1-12。1,24)CE中毒患者可出現(xiàn)頭暈、情感淡 漠、譫妄、抽搐、記憶力下降、反應(yīng)遲鈍、計(jì)算力下降等 臨床癥狀M ;患者病情遷延，易反復(fù)或突然惡化，后遺 癥發(fā)生率及死亡率高對生命和健康影響極大。因 此，研究1,24)CE對神經(jīng)行為的影響對闡明其神經(jīng)毒 性具有重要意義。
本課題組前期的Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，以 劑量為100和350 mg/m3的1,24)CE靜式吸入連續(xù)染 毒28 d,可引起小鼠空間學(xué)習(xí)和記憶能力下降，且隨 著染毒劑量增加和時(shí)間延長，其毒性效應(yīng)增強(qiáng)M。楊 光謙等15的研究以劑量為1 200 mg/m3的1,2-)CE 靜式吸入染毒3 d,結(jié)果導(dǎo)致小鼠出現(xiàn)腦損傷，行為學(xué) 表現(xiàn)為抱爪現(xiàn)象。曠場實(shí)驗(yàn)主要用于評價(jià)實(shí)驗(yàn)動物 在新異環(huán)境（即開闊環(huán)境）中的自主行為、探究行為與 緊張度16。糖水偏愛實(shí)驗(yàn)可反映大鼠欣快感E7]。強(qiáng) 迫游泳實(shí)驗(yàn)也被稱為絕望實(shí)驗(yàn),是經(jīng)典的抑郁類行為 學(xué)實(shí)驗(yàn)，主要測量動物的活躍性；其中的漂浮行為被 用作分析“絕望”的參數(shù)，因此也被認(rèn)為是類似抑郁的 行為M。本課題組前期以劑量為79 mg/kg體質(zhì)量的
職業(yè)性有機(jī)溶劑接觸可對職業(yè)工人的心理健康 狀況產(chǎn)生不同程度的損害。有研究結(jié)果顯示，苯系物 職業(yè)接觸可引起女性工人在人際關(guān)系敏感、抑郁、焦 慮、敵對4個(gè)因子評分上明顯上升E9];正已烷接觸工 人消極情緒（緊張-焦慮、抑郁-沮喪、憤怒-敵意、 疲憊-惰性、困惑-迷茫）得分升高，而心算平均準(zhǔn)確 數(shù)、心算能力平均指數(shù)、聽數(shù)字廣度平均準(zhǔn)確數(shù)、聽數(shù) 字廣度能力指數(shù)、曲線吻合平均準(zhǔn)確數(shù)、曲線吻合平 均能力指數(shù)、目標(biāo)追蹤平均準(zhǔn)確數(shù)均下降M ; 1,24)CE中毒性腦病患者的焦慮和抑郁評分值明顯升 高M ;但機(jī)制尚不清楚。抑郁癥病因復(fù)雜，且受多種 環(huán)境、生理和心理性因素影響°22。目前抑郁癥病因機(jī) 制主要研究包括：炎癥假說、氧化應(yīng)激假說、神經(jīng)營養(yǎng) 假說和神經(jīng)遞質(zhì)假說等^-25 ;其中以單胺神經(jīng)遞質(zhì) 假說為久遠(yuǎn)成熟，該機(jī)制認(rèn)為腦內(nèi)單胺類神經(jīng)遞質(zhì) 如5~HT、NA、多巴胺等的缺乏或代謝異常是導(dǎo)致抑郁 癥的主要因素^6-28。抑郁癥患者腦的結(jié)構(gòu)和功能 改變主要存在于前額皮層、海馬和紋狀體等29];而精 神活動的異常與中樞神經(jīng)系統(tǒng)突觸內(nèi)的單胺類遞質(zhì) 5~HT、NA和多巴胺代謝水平失衡密切相關(guān)°9。本研 究發(fā)現(xiàn)，隨著1,2~DCE染毒劑量增加，大鼠紋狀體、海 馬和前額皮層中5~HT、NA和多巴胺均呈下降趨勢 (P<0.05);其中，高劑量組大鼠3個(gè)腦區(qū)中5~HT、NA 和多巴胺水平均低于對照組（P < 0. 05);提示
綜上所述，1，2—)CE亞急性暴露可誘導(dǎo)大鼠出現(xiàn) 抑郁樣行為，其機(jī)制可能與降低前額皮層、海馬和紋 狀體內(nèi)單胺類神經(jīng)遞質(zhì)的水平變化有關(guān)。但該機(jī)制 研究只是對神經(jīng)遞質(zhì)改變的初步探討，具體哪些相關(guān) 信號通路(蛋白和RNA)參與了該過程尚需進(jìn)一步深 入研究。
