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目的
建立跳臺反射法耳鳴動物行為學(xué)模型，豐富動物耳鳴的建模方法。
方法
Wistar大鼠20只，隨機平均分為2組：水楊酸組和對照組（每日分別經(jīng)腹腔注射10 %水楊酸鈉350 mg/kg/天和生理鹽水）。動物于隔音室內(nèi)進行條件反射訓(xùn)練。經(jīng)10～14天的強化訓(xùn)練后，動物形成“聲刺激-跳臺逃避”的條件反射。條件反射建立后動物給藥，分別記錄兩組動物在給聲期間及刺激間期跳上跳臺的次數(shù)。結(jié)果 水楊酸組動物給藥后每10次刺激間期中出現(xiàn)的跳臺動作為（3.9±1.6）次，經(jīng)方差分析，與對照組存在顯著性差異（P<0.05），說明大鼠經(jīng)注射水楊酸鈉后有耳鳴的產(chǎn)生。
結(jié)論
跳臺法耳鳴動物模型可有效驗證水楊酸動物耳鳴的產(chǎn)生，可為耳鳴的基礎(chǔ)研究提供一種理想模型。
耳鳴為耳科常見病，據(jù)英國的一項調(diào)查研究顯示，在成年人中，大約有10％的人曾患有持續(xù)性自發(fā)性耳鳴（prolonged spontaneous tinnitus），其中約1％的患者因嚴(yán)重的耳鳴而產(chǎn)生煩躁、焦慮和抑郁等癥狀，嚴(yán)重影響日常生活和工作。約2.5％的成年人因耳鳴癥狀曾入院治療。長期以來，由于缺少有效的動物耳鳴疾病模型，使得人們對耳鳴發(fā)生機理的研究進展緩慢，從而大大制約了耳鳴的治療進展。由于動物無法像人類那樣通過語言來描述耳鳴的產(chǎn)生，所以建立某種條件反射，通過對動物行為的觀察來間接判斷動物耳鳴的產(chǎn)生就成為建立耳鳴動物模型的基本原理。1988年Jastreboff等通過飲水抑制法，提出了Di一個經(jīng)典的急性水楊酸鹽耳鳴動物模型，使人們能夠深入研究耳鳴的發(fā)生機制和治療。2003年Guitton等對大鼠耳鳴的研究中利用跳臺反射的方法，通過建立一種“聲音刺激-電擊-逃避反應(yīng)”的行為模式來觀察動物耳鳴，同樣也取得了較好的效果。本研究的目的是參考Guitton等的方法并加以適當(dāng)改進，建立跳臺法耳鳴動物行為學(xué)模型，提供另一種有效的耳鳴建模方法。
1.1 動物 健康雄性白色Wistar大鼠20只，由北京維通利華實驗動物中心提供，并于北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部動物實驗中心飼養(yǎng)。所有動物耳道清潔，耳廓反射靈敏，對電刺激反應(yīng)敏感，體重285 g～468 g，平均354 g。
1.2 主要試劑與儀器 水楊酸鈉（sodium salicylate，美國Sigma公司）；屏蔽訓(xùn)練箱（自制）；大鼠跳臺儀（上海欣軟信息科技有限公司，XR-3TD型）；飛樂牌揚聲器（YD-2502型，8Ω）；音頻信號發(fā)生器（GW GFG-8016D型）；功率放大器（紅巖牌HY5885A-400型）；示波器（ARON-BS5504型）；力盾牌數(shù)字時間繼電器（JS48S-S型）。
1.3 方法
1.3.1 動物分組 將動物平均隨機分為2組，第1組為水楊酸組，第2組為對照組，每組10只。
1.3.2 建立條件反射 動物于隔音室內(nèi)適應(yīng)性分籠喂養(yǎng)，每籠4只。室內(nèi)溫度恒定控制在25℃，人工控制照明12小時燈光開/關(guān)使動物的晝夜節(jié)律保持穩(wěn)定，飲食及飲水充足，一直到實驗結(jié)束。
條件反射訓(xùn)練于另一隔音室內(nèi)進行，各頻率背景噪聲均<25 dB SPL，每只動物均單獨進行訓(xùn)練。動物置于自制的屏蔽訓(xùn)練箱內(nèi)，箱頂揚聲器給予10kHz，60 dB SPL的外界聲刺激作為條件刺激，持續(xù)時間為10秒，非條件刺激為動物足底電擊（5mA），持續(xù)時間8秒，條件刺激和非條件刺激出現(xiàn)的時間間隔為2秒。訓(xùn)練動物當(dāng)聽到聲刺激信號后，因足底受到電擊而產(chǎn)生向箱內(nèi)絕緣跳臺跳躍的逃避反應(yīng)。每次訓(xùn)練的間隔期為3分鐘。每只動物每天連續(xù)訓(xùn)練10次為一個訓(xùn)練系列。記錄動物在給聲期間及刺激間期的行為反應(yīng)，正確反應(yīng)率為給聲期間動物正確跳上跳臺的百分率。經(jīng)過4～5天的適應(yīng)性訓(xùn)練，動物開始學(xué)會建立“聲刺激-跳臺逃避”的條件反射，連續(xù)4天未學(xué)會跳臺逃避的動物即被淘汰。再經(jīng)過7～10天的強化訓(xùn)練，使此條件反射加強并穩(wěn)定。當(dāng)每只動物至少在連續(xù)3個訓(xùn)練系列中對聲音的正確反應(yīng)率均≥80％，即可判定為條件反射建立成功。
隔音箱+跳臺箱，型號：XR-3TB
1.3.3 行為監(jiān)測 當(dāng)動物條件反射建立成功后，即進入實驗觀察期，觀察藥物對動物行為反應(yīng)的影響。此階段的動物行為觀測指標(biāo)為：①正確反應(yīng)率，為外界給聲時動物正確跳上跳臺的百分率；②假陽性反應(yīng)，為每個訓(xùn)練系列中動物在刺激間期的前1分鐘內(nèi)跳上跳臺的次數(shù)。足底電擊只在聲刺激后動物未能正確跳上跳臺時隨機給予。刺激間期動物若在跳臺上停留時間超過10秒，則人工將動物取下。整個行為監(jiān)測分為3個階段，給藥前期（1～2天）。給藥期（3～6天）：水楊酸組動物每日經(jīng)腹腔注射10％水楊酸鈉350 mg/kg，對照組每日經(jīng)腹腔注射生理鹽水350mg/kg。所有動物均連續(xù)給藥4天，并于每次給藥后2小時進行動物行為測試，記錄動物行為反應(yīng)指標(biāo)的變化。停藥期（7～11天）：兩組動物分別停止應(yīng)用水楊酸鈉和生理鹽水，連續(xù)記錄停藥5天的動物行為反應(yīng)指標(biāo)。
1.3.4 統(tǒng)計分析 所有實驗數(shù)據(jù)均經(jīng)SPSS 12.0統(tǒng)計軟件處理，對實驗結(jié)果進行雙因素方差分析。第1組動物注射水楊酸鈉（3～6天）后2小時對聲音的正確反應(yīng)率為（86.8±3.3）%，與給藥前相比（91.9±0.8）％，曲線呈輕度下降（P<0.05），停藥后逐漸恢復(fù)至給藥前水平（圖1）。第1組動物在給藥期的假陽性反應(yīng)為（3.9±1.6）次，曲線較給藥前上升明顯（圖2）。與對照組動物相比，動物注射水楊酸后假陽性反應(yīng)明顯增加，經(jīng)方差分析，二者存在顯著性差（P<0.05）。對照組動物各期之間的行為學(xué)指標(biāo)無顯著性差異（P>0.05）。結(jié)果證明，水楊酸組動物確實感覺到了耳鳴的存在。在聲刺激的間隔期，盡管沒有外界聲刺激存在，但動物因感受到了耳鳴信號，從而誘發(fā)了對電擊的恐懼反應(yīng)，導(dǎo)致出現(xiàn)跳臺動作，假陽性反應(yīng)明顯增加。
3. 討論
水楊酸類藥物對人體具有明顯的耳毒性作用，長期大劑量使用會導(dǎo)致耳鳴、聽力下降，停藥后癥狀逐漸消失。臨床觀察聽力正常者長期服用大劑量（>350 mg/kg）水楊酸鹽后，幾乎100%有不同程度耳鳴產(chǎn)生。其血藥濃度于1～1.5小時后達峰值。由于水楊酸鹽具有引起耳鳴的成功率高、操作簡單、全身副作用小等優(yōu)點，因此，經(jīng)水楊酸鹽誘導(dǎo)建立的耳鳴動物模型是目前Z常用、有效的建模方法。1994年Jastreboff等利用飲水抑制方法，*成功設(shè)計出一套完整的經(jīng)水楊酸鹽誘導(dǎo)的動物急性耳鳴行為學(xué)模型，并通過試驗測得水楊酸鈉引起的耳鳴在聲音特性上與10 kHz，70 dB的純音基本一致。
耳鳴動物模型設(shè)計的基本原理是建立某種與耳鳴信號相關(guān)的條件反射，通過動物的行為學(xué)指標(biāo)對動物有無耳鳴加以判斷。根據(jù)經(jīng)典條件反射和操作性條件反射的原理，形成條件反射的基本條件就是條件刺激與非條件刺激在時間上的結(jié)合，這個過程稱為強化。一般來說，一切來自體內(nèi)外的有效刺激只要跟非條件刺激在時間上結(jié)合（即強化），都可以成為條件刺激，形成條件反射，例如食物性條件反射、防御性條件反射等。基于以上原理，2003年Guitton等利用跳臺法建立的耳鳴動物模型同樣取得了令人滿意的結(jié)果。本模型通過將“聲刺激”和“電擊-跳臺反應(yīng)”在時間上進行結(jié)合、加強并終使動物建立“聲刺激-跳臺逃避行為”的條件反射。條件反射建立后，動物對聲音（10 kHz，60 dB SPL）反應(yīng)敏感，并且通過7～10天的條件強化，動物對此條件反射的記憶時間較長，平均在6～7天內(nèi)對聲音的正確反應(yīng)率可維持在80％以上，因此較為適合實驗周期相對較長的耳鳴實驗。另外，與飲水抑制法相比，此模型還具有在實驗過程中對動物的全身狀態(tài)影響較小的優(yōu)點，因此較適合應(yīng)用于實驗中對動物身體狀態(tài)有特殊要求的情況，如實驗中對耳鳴動物進行的手術(shù)干預(yù)等。
本實驗采用Guitton等創(chuàng)立的跳臺法建立耳鳴動物模型，并對其訓(xùn)練方法加以如下改進：
①針對文獻報道的條件聲刺激持續(xù)3秒，條件刺激結(jié)束1秒后給予30秒的非條件刺激的方式，考慮到耳鳴為持續(xù)性信號的特點，我們將條件聲刺激增加為10秒，以使外界聲信號與耳鳴的存在形式更為相似。非條件刺激時間持續(xù)8秒，使動物在接受電擊的同時始終有聲刺激的存在。
②文獻要求在條件刺激結(jié)束1秒后給予非條件刺激，但實驗過程中發(fā)現(xiàn)動物較難在1秒內(nèi)對聲音作出正確反應(yīng)，我們將非條件刺激改為在條件刺激結(jié)束2秒后給予，取得良好效果。
③文獻中每次條件訓(xùn)練的間隔期為1分鐘，我們在實驗中發(fā)現(xiàn)，訓(xùn)練間隔期過短往往會造成動物對條件反射的過度強化，動物在間隔期沒有聲刺激的情況下后仍然出現(xiàn)頻繁的跳臺行為，導(dǎo)致正常狀態(tài)下的假陽性反應(yīng)過高，影響實驗結(jié)果，對此我們將每次訓(xùn)練的間隔期延長為3分鐘，有效控制了假陽性率的出現(xiàn)。
我們認(rèn)為利用跳臺反射法建立的耳鳴動物行為模型具有成功率高、穩(wěn)定且可操作性好的優(yōu)點，可以應(yīng)用于對耳鳴發(fā)生機制方面的研究。
